741.三年后的问候(1/3)
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明天1011点739/740明天中午放出研究背景尽管在手术、放疗和分子靶向治疗方面取得了进展，非小细胞肺癌的死亡率仍然很高。针对程序性细胞死亡蛋白配体1(PDL1)程序性细胞死亡蛋白1(PD1)轴的ICIs通过激活细胞毒性T细胞活性来促进肿瘤细胞的杀伤。虽然这些抑制剂已经被批准用于晚期NSCLC的治疗，但由于肿瘤微环境(TME)中存在多种免疫抑制屏障，大多数患者几乎没有临床获益。因此，迫切需要努力寻找能够克服这些屏障，提高ICIs疗效的免疫调节剂。RT具有潜在的免疫调节特性，因为它可以触发免疫原性细胞死亡和激活抗原提呈细胞，使肿瘤特异性T细胞交叉激活，不仅可以限制原发肿瘤的生长，还可以产生针对远处(非内窥镜)转移灶的全身性效应。不幸的是，最佳的RT剂量和潜在的分子机制取决于癌症的类型，对于非小细胞肺癌，包括诱导最佳免疫调节的测序和剂量/分割方案，目前还知之甚少。新出现的证据支持ICIs和RT联合治疗包括NSCLC在内的各种肿瘤类型的可能性。一项I期试验显示，以前接受过放射治疗的NSCLC患者在接受ICIs治疗的情况下比没有接受过RT治疗的患者有更长的无进展生存期。然而，由于之前的试验缺乏确定的分子机制，目前的临床试验测试这种组合是由经验选择指导的，而这些选择可能并不是最优的。在这里，我们提供了机械性的见解，可能会加速非小细胞肺癌RT和ICIs联合治疗的发展。
技术路线研究结果特定剂量的RT可增强PD1阻滞剂的疗效在正在进行的人类和鼠肿瘤的研究中，已经报道了不同剂量的低分割RT，并提出了剂量和分割的关键重要性。因此，我们首先优化了微计算机断层扫描(CT)引导下的HKP1荷瘤肺RT方案，该方案可以提高PD1抑制的治疗效果。我们测试了一种先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的RT方案：8Gy连续3天(8Gy×3)，以及两种较低剂量的方案，4Gy×3和0.5Gy×3(图1a)。值得注意的是，4Gy×3(4GyRT)联合PD1抗体可显著控制肿瘤(图1b，c)并提高存活率(图1d)。此外，40的小鼠无瘤存活，而仅接受PD1抗体治疗的队列小鼠的无瘤存活率为10。与单独抑制PD1相比，0.5Gy×3和8Gy×3的其他剂量联合PD1抑制并不能显著控制肿瘤或提高生存率(图1e，f)。
通过联合治疗获得持久的T细胞活性为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了T细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4GyRT显示在肿瘤胰岛浸润的CD8T细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在HKP1肺中干扰素y/肿瘤坏死因子a/CD4T细胞和Gz/CD8T细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4GyRT诱导的T细胞活性与其抑制PD1的协同作用是一致的。越来越多的T细胞被招募到HKP1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为CD4T细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素y和肿瘤坏死因子a(扩展数据图2a，b)。为了确定4GyRT是否增强了原有T细胞的功能，我们用S1P受体抑制剂FTY720治疗HKP1小鼠，FTY720可以阻止活化的T细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，FTY720治疗通过减少循环T细胞(扩展数据图2d)，将4GyRT的效果局限于肺部原有的T细胞。与对照组相比，FTY720取消了4GyRT增加干扰素y/肿瘤坏死因子a/CD4T细胞和Gz/CD8T细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在FTY720处理的小鼠中，4GyRT和抗PD1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4GyRT并不能重新激活TME中原有的功能紊乱的T细胞。
4GyRT治疗可激活TME中的肺驻留棒状细胞为了探索4GyRT诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了RT诱导的树突状细胞(DC)的激活。4GyRT治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中CD103交叉呈递的DC(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受RT(0Gy、4Gy或8Gy×3)联合IgG或PD1抗体治疗的HKP1肺进行RNASEQ分析。比较4GyRT组、0Gy(模拟)组和8GyRT(无效剂量)组在抗PD1治疗前后的差异表达基因(Pa;a;lt;0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将IgG队列中4GyRT上调的基因与抗PD1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个GyRT特征基因的细胞来源，我们对接受0Gy或4GyRT的HKP1荷瘤肺进行了单细胞RNAseq(scRNAseq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(tSNE)图，我们发现这些基因在4GyRT后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。
棒状细
技术路线研究结果特定剂量的RT可增强PD1阻滞剂的疗效在正在进行的人类和鼠肿瘤的研究中，已经报道了不同剂量的低分割RT，并提出了剂量和分割的关键重要性。因此，我们首先优化了微计算机断层扫描(CT)引导下的HKP1荷瘤肺RT方案，该方案可以提高PD1抑制的治疗效果。我们测试了一种先前报道在乳腺癌模型中具有免疫调节活性的RT方案：8Gy连续3天(8Gy×3)，以及两种较低剂量的方案，4Gy×3和0.5Gy×3(图1a)。值得注意的是，4Gy×3(4GyRT)联合PD1抗体可显著控制肿瘤(图1b，c)并提高存活率(图1d)。此外，40的小鼠无瘤存活，而仅接受PD1抗体治疗的队列小鼠的无瘤存活率为10。与单独抑制PD1相比，0.5Gy×3和8Gy×3的其他剂量联合PD1抑制并不能显著控制肿瘤或提高生存率(图1e，f)。
通过联合治疗获得持久的T细胞活性为了阐明不同放疗剂量的不同影响，我们在最后一次放疗后1d(放疗开始后第4天)检测了T细胞浸润和细胞因子的产生。在所有被检查的队列中，4GyRT显示在肿瘤胰岛浸润的CD8T细胞数量最多(图2a和扩展数据图1a)，在HKP1肺中干扰素y/肿瘤坏死因子a/CD4T细胞和Gz/CD8T细胞数量最多(图2b，c和扩展数据图1b)。这些4GyRT诱导的T细胞活性与其抑制PD1的协同作用是一致的。越来越多的T细胞被招募到HKP1肺部，逐渐获得功能障碍的表型，表现为CD4T细胞的效应细胞因子表达减少，如干扰素y和肿瘤坏死因子a(扩展数据图2a，b)。为了确定4GyRT是否增强了原有T细胞的功能，我们用S1P受体抑制剂FTY720治疗HKP1小鼠，FTY720可以阻止活化的T细胞从淋巴结流出(扩展数据图2c)。正如预期的那样，FTY720治疗通过减少循环T细胞(扩展数据图2d)，将4GyRT的效果局限于肺部原有的T细胞。与对照组相比，FTY720取消了4GyRT增加干扰素y/肿瘤坏死因子a/CD4T细胞和Gz/CD8T细胞的能力(扩展数据图2e)。因此，在FTY720处理的小鼠中，4GyRT和抗PD1联合治疗的效果被取消(扩展数据图2f)。这些发现表明，4GyRT并不能重新激活TME中原有的功能紊乱的T细胞。
4GyRT治疗可激活TME中的肺驻留棒状细胞为了探索4GyRT诱导抗肿瘤免疫反应的机制，我们检测了RT诱导的树突状细胞(DC)的激活。4GyRT治疗既没有引起肿瘤细胞死亡(扩展数据图4a)，也没有增加支气管淋巴结中CD103交叉呈递的DC(扩展数据图4b)。接下来，我们对接受RT(0Gy、4Gy或8Gy×3)联合IgG或PD1抗体治疗的HKP1肺进行RNASEQ分析。比较4GyRT组、0Gy(模拟)组和8GyRT(无效剂量)组在抗PD1治疗前后的差异表达基因(Pa;a;lt;0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通过将IgG队列中4GyRT上调的基因与抗PD1队列重叠，我们识别了144个特定于该有效辐射剂量上调的基因(图3a和扩展数据图5a)。为了确定这4个GyRT特征基因的细胞来源，我们对接受0Gy或4GyRT的HKP1荷瘤肺进行了单细胞RNAseq(scRNAseq)分析。通过将144个签名基因投影到t分布随机邻居嵌入(tSNE)图，我们发现这些基因在4GyRT后在气道上皮/棒状细胞簇中显著上调(图3b)。
棒状细