741.三年后的问候(2/3)
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胞分泌体与联合治疗的疗效有关无论采用哪种耗竭方法，携带HKP1的肺对4GyRT的免疫反应均明显减弱，表现为T细胞向肿瘤胰岛的浸润显著减弱，效应细胞因子的产生减少(CD4T细胞中的干扰素y/肿瘤坏死因子a和CD8T细胞中的Gz)(图4C和扩展数据图6d)。值得注意的是，在HKP1荷瘤小鼠中，棒状细胞缺陷取消了联合治疗的疗效(图4d)。
电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4GyRT治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高ICIs疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用Scgb1a1CreERTM/Snap23Flox/Flox转基因小鼠(简称Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺TME。突触体相关蛋白23(SNAP23)是SNARE复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失Snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析证实，与野生型对照相比，4GyRT治疗的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分CC10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺对4GyRT反应中T细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。
棒状细胞减少促肿瘤炎症球状细胞缺陷(DT治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(Mye/LYM，对照组和DT治疗小鼠分别为0.96和1.34，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如IL1b、PTGS2和TNF(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的TME改变可能影响了T细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，T细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应T细胞簇(C5)显示细胞因子、效应分子(干扰素y和肿瘤坏死因子)和T细胞活化标志物(PDCD1和CTLA4)表达增加，增殖T细胞簇(C9)显示颗粒酶和Ki67表达，调节性T细胞簇(C8)显示Foxp3和IL2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为2.63和1.96)相比，去杆状细胞(DT治疗)降低了效应器、增殖T细胞和Treg细胞的比率((C5C9)/C8)。总之，这些scRNAseq结果表明，RT激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制HKP1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。BALF样本的ELISA检测显示，与0Gy对照组相比，4GyRT显著降低了HKP1TME中IL1b、PGE_2和TNFa的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(DT处理的Scgb1a1cre/iDTR)或其分泌体(Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)的情况下，4GyRT未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明RT诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在II期新辅助临床试验(NCT02904954)54中评估了接受RT联合ICIs(抗PDL1)治疗的NSCLC患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(SBRT)前1d和末次SBRT后1d采集血浆。匹配患者的CC10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆CC10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，P0.0301)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，RT激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了HKP1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。
棒状细胞因子改善PD1受体阻滞剂的疗效这些体外研究结果促使我们研究棒状鸡尾酒是否能反映4GyRT在改善体内PD1阻断方面的效果。我们每天给HKP1小鼠鼻内注射棒状鸡尾酒(每只小鼠每只蛋白20ng)，连续3d(第1113天)，并联合PD1抗体(图8a)。值得注意的是，与模拟对照相比，联合PD1抗体的棒状鸡尾酒治疗可显著控制肿瘤并提高HKP1小鼠的存活率(图8b，c)。与4GyRT相似，支气管肺泡灌洗液分析显示，与对照组相比，棒状鸡尾酒治疗组小鼠的肿瘤坏死因子a、前列腺素E_2和IL1b水平较低(图8d)。最后，为了确定棒状鸡尾酒和PD1抗体联合治疗是否能产生持久的抗肿瘤免疫，我们进行了肿瘤再攻击实验。事实上，与对照组相比，存活的小鼠在35天内清除了肺部的肿瘤细胞(扩展数据图10e)。总之，这些发现表明，棒状细胞分泌蛋白通过抑制免疫抑制的MDSCs和增强T细胞功能来提高PD1阻断的疗效。
研究小结在NSCLC模型
电子显微镜对棒状细胞的进一步表征显示，与对照组相比，从4GyRT治疗的肺中分离出的棒状细胞中分泌囊泡的数量增加(扩展数据图8a，b)。我们推测放疗后棒状细胞的分泌可能在提高ICIs疗效中起作用。为了解决这个问题，我们使用Scgb1a1CreERTM/Snap23Flox/Flox转基因小鼠(简称Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒状细胞分泌蛋白进入肺TME。突触体相关蛋白23(SNAP23)是SNARE复合体的关键成分，它介导细胞内囊泡融合到膜上，调节胞吐。他莫昔芬治疗Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允许有条件的棒状细胞特异性缺失Snap23基因(图5a)，而不改变细支气管的完整性(扩展数据图8c)。对支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析证实，与野生型对照相比，4GyRT治疗的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒状细胞分泌组成分CC10显著减少(图5b)。与棒状细胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺对4GyRT反应中T细胞的浸润和激活(图5c和扩展数据图8d)。
棒状细胞减少促肿瘤炎症球状细胞缺陷(DT治疗)小鼠的肺显示髓系/淋巴细胞比率增加(Mye/LYM，对照组和DT治疗小鼠分别为0.96和1.34，图6a)。此外，杆状细胞缺陷肺中的髓样细胞表现出炎症介质的表达增加，如IL1b、PTGS2和TNF(图6b)，据报道它们可以抑制适应性抗肿瘤免疫。我们推测这些棒状细胞介导的TME改变可能影响了T细胞效应器的表型。使用基于图形的分类，T细胞被分成9个簇(图6c)，每个簇的功能状态根据它们的特征基因来确定(图6c和补充表2)。我们观察到效应T细胞簇(C5)显示细胞因子、效应分子(干扰素y和肿瘤坏死因子)和T细胞活化标志物(PDCD1和CTLA4)表达增加，增殖T细胞簇(C9)显示颗粒酶和Ki67表达，调节性T细胞簇(C8)显示Foxp3和IL2ra表达(图6c)。值得注意的是，与对照组(分别为2.63和1.96)相比，去杆状细胞(DT治疗)降低了效应器、增殖T细胞和Treg细胞的比率((C5C9)/C8)。总之，这些scRNAseq结果表明，RT激活的棒状细胞的存在有助于适应性抗肿瘤免疫，可能是通过限制HKP1肿瘤中髓系细胞介导的炎症。BALF样本的ELISA检测显示，与0Gy对照组相比，4GyRT显著降低了HKP1TME中IL1b、PGE_2和TNFa的水平(图6d)，但在没有棒状细胞(DT处理的Scgb1a1cre/iDTR)或其分泌体(Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)的情况下，4GyRT未能减少这些炎症因子(图6d)。为了证明RT诱导的棒状细胞分泌体的临床相关性，我们在II期新辅助临床试验(NCT02904954)54中评估了接受RT联合ICIs(抗PDL1)治疗的NSCLC患者的血浆水平。分别于首次立体定向全身放射治疗(SBRT)前1d和末次SBRT后1d采集血浆。匹配患者的CC10血浆浓度比较(放疗前和放疗后)显示，大多数获得病理改善的患者在放疗后血浆CC10水平升高(8人中有5人)，而无反应的患者(9人中有0人，P0.0301)(图6e)，表明棒状细胞激活与联合治疗的病理反应有关。综上所述，这些发现表明，RT激活的棒状细胞通过其分泌体抑制了HKP1肺中的肿瘤前炎症，从而增强了适应性抗肿瘤免疫。
棒状细胞因子改善PD1受体阻滞剂的疗效这些体外研究结果促使我们研究棒状鸡尾酒是否能反映4GyRT在改善体内PD1阻断方面的效果。我们每天给HKP1小鼠鼻内注射棒状鸡尾酒(每只小鼠每只蛋白20ng)，连续3d(第1113天)，并联合PD1抗体(图8a)。值得注意的是，与模拟对照相比，联合PD1抗体的棒状鸡尾酒治疗可显著控制肿瘤并提高HKP1小鼠的存活率(图8b，c)。与4GyRT相似，支气管肺泡灌洗液分析显示，与对照组相比，棒状鸡尾酒治疗组小鼠的肿瘤坏死因子a、前列腺素E_2和IL1b水平较低(图8d)。最后，为了确定棒状鸡尾酒和PD1抗体联合治疗是否能产生持久的抗肿瘤免疫，我们进行了肿瘤再攻击实验。事实上，与对照组相比，存活的小鼠在35天内清除了肺部的肿瘤细胞(扩展数据图10e)。总之，这些发现表明，棒状细胞分泌蛋白通过抑制免疫抑制的MDSCs和增强T细胞功能来提高PD1阻断的疗效。
研究小结在NSCLC模型